流式细胞技术应用
来源: | 作者:pmo920a68 | 发布时间: 2016-02-29 | 3143 次浏览 | 分享到:

流式细胞术 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不....

      流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量 细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

      流式细胞仪的构造与工作原理

      流式细胞仪主要由以下五部分构成:
      ①流动室及液流驱动系统
      ②激光光源及光束形成系统
      ③光学系统
      ④信号检测与存储、显示、分析系统
      ⑤细胞分选系统。

      1. 流动室及液流驱动系统
      流动室(Flow Cell 或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,由石英玻璃制成。单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。

      2. 激光光源及光束形成系统
      常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),使通过激光检测区的细胞受照强度一致。



 
      3. 光学系统
      流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。
      ①流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰。
      ②流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)--只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)-- 只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)-- 只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT 前面配置的滤光片是LP550 和BP525, 接收色橙红色荧光(PE)的PMT 前面配置的滤光片是LP600 和BP575, 接收红色荧光(CY5)的PMT 前面配置的滤光片是LP650 和BP675。

      4. 信号检测、显示、分析系统
      当测定标本在鞘流液约束 下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900 散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的 单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是大发bet手机网页版要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是大发bet手机网页版测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出 的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。
      前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变 为电信号;侧向角散射或900 散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。
      流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射 光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波 长633ηm)。488ηm 激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红 蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是:                
激发光波长(ηm)    发射光峰值(ηm)
                   FITC            488                          525(绿)
                   PE               488                        575(橙红)
                   PI                488                        630(橙红)
                   ECD            488                          610(红)
                   CY5            488                        675(深红)
                   PreCP        488                        675(深红)
      各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.

      5. 细胞分选系统
      存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的。采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。
      流式细胞仪的应用:
      流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
      ①     细胞生物学:细胞凋亡研究;定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系,进行染色体核型分析,并可纯化X或Y染色体。
      ②     肿瘤学:DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。
      ③     免疫学:研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系;进行免疫活性细胞的分型与纯化;分析淋巴细胞亚群与疾病的关系;免疫缺陷病如艾滋病的诊断;器官移植后的免疫学监测等。
      ④     血液学:血液细胞的分类、分型,造血细胞分化的研究,血细胞中各种酶的定量分析,如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT及DNA双染色法可研究白血病细 胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系,检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞,以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免 疫复合物可以诊断自身免疫性疾病,如红斑狼疮等。
      ⑤     药物学:检测药物在细胞中的分布,研究药的作用机制,亦可用于筛选新药,如化疗药物对肿瘤的凋亡机制,可通过测DNA凋亡峰,Bcl-2凋亡调节蛋白等。
      流式细胞仪实验方法
      流式细胞仪技术,主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点 时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转 换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。
      样品制备方法
      流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。
      标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经Ficoll分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维 样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等),化学法(EDTA、EGTA和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS,柠檬酸盐的浓度为 40μmol/L,并同时采用机械分散法
      流式细胞术Protocol研究示例
       1. 细胞凋亡研究:细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡,在疾病发生、发展中有重要作用,因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多,应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。
       2. 细胞分选:流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度>95%。目前细胞分选主要用于研究,临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞,只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。
      3. 细胞因子的检测:随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。
      4. 血液学应用:

      本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用,包括DNA倍体分析及细胞周期分析,淋巴细胞亚群测定,白血病免疫分型,淋巴瘤免疫分型,红细胞疾病诊断,血 小板功能分析和血小板病诊断,微小残留白血病检测,白细胞吞噬功能测定,NK和LAK细胞活性测定,造血干/祖细胞测定等。