免疫组化技术支持
来源: | 作者:pmo920a68 | 发布时间: 2016-02-29 | 3443 次浏览 | 分享到:

一、产品目录 二、免疫组化操作步骤及免疫组化染色过程中出现的问题、原因分析及解决方法 1、免疫组化操作步骤: ①脱蜡和水化:脱蜡前应将组织切片在室温中放置60分钟或60℃恒....


一、产品目录

 
 

二、免疫组化操作步骤及免疫组化染色过程中出现的问题、原因分析及解决方法

1、免疫组化操作步骤:
  ①脱蜡和水化:脱蜡前应将组织切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
  A、组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟
  B、无水乙醇中中浸泡5分钟,更换无水乙醇后再浸泡5分钟
  C、95%、80%、70%和50%乙醇中各浸泡5分钟
  ②抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织
  A、热修复:用pH 6.0的柠檬酸缓冲液或pH 9.0的EDTA缓冲液通过高压或煮沸进行热修复
  B、酶消化修复
  ③封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2孵育5分钟
  ④一抗孵育:4℃过夜孵育或37℃温箱孵育1-2小时
  ⑤二抗孵育:37℃孵育1小时
  ⑥DAB显色:孵育时间根据染色深浅决定
  ⑦复染及封片

2、免疫组化染色过程中出现的问题、原因分析及解决方法

一、无/弱染色
    染色结束后,切片中见不到任何阳性信号或出现微弱的阳性信号,这是常规工作中比较常见的现象。一般有两种可能:
    1、真阴性结果,受测组织中不表达与抗体相关的抗原。
    2、出现假阴性结果,有可能是染色过程中某一或某些环节出现了问题。比如,组织固定不及时可能会导致组织的自溶;固定液选择不当可能会破坏组织标本中的抗 原;组织固定时间不够可能会造成蛋白弥散或降解,过固定可能会造成蛋白空间结构交联过度;受测组织中抗原含量低;抗原修复不当,抗原修复液选择不当、需要 酶修复却选择了热修复,或是无需抗原修复却进行了抗原热修复等均可导致阴性染色结果的出现;一抗的选择错误,选用了只能用于冰冻切片而不能用于石蜡切片的 一抗;一抗失效或超过有效期;一抗二抗染色系统不匹配也会造成染色结果阴性,比如通用型染色系统只能检测小鼠和兔来源的一抗,不能用于山羊来源的一抗的检 测;操作不当造成的染色结果阴性,比如组织切片上残留的清洗液过多,进一步稀释了一抗,操作步骤或滴加试剂顺序颠倒或漏加某种试剂,均可导致无阳性信号。

    可以通过设立阳性对照来解决以上可能出现的问题。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴 性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题,应一一寻找原因。阳性对照包 括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一 张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种 称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含受测抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已 知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。

二、背景染色
    免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色产生的原因也多种多样。主要分为以下几种:

1、全片着色
      全片着色是指整个切片全都染上了颜色,着色的强度可深可浅,总之,分不清哪些组织是阳性哪些组织是阴性。出现这种现象的原因有:
   (1)、抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。
   (2)、抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规程。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整。
   (3)、DAB变质和显色时间太长:DAB最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也 会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监 控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时 间过长。
  (4)、组织变干:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。
  (5)、一抗变质、质量差的多克隆抗体:注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

2、 切片边缘着色
    切片边缘着色也是一种常见的现象,这种现象称为边缘效应。产生的原因:
      (1)、组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织松脱漂浮在液体中,每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法:组织的前期处理应规范,尽量避免选用坏死较多的组织。
      (2)、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织,边缘的试剂容易首先变干,浓度较中心组织高而致染色深。解决办法:试剂要充分覆盖组织,应超出组织边缘2 mm。

3、“阴阳脸”着色
       指组织一半着色一半无着色,形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织 上。通常应该在加完试剂后,仔细看一遍,是否有的组织未被试剂完全覆盖,如有这种情况,建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆 盖。另外,染片盒不平,切片倾斜,虽然开始试剂已全部覆盖了组织,但后来试剂流向一边,部分组织未被试剂覆盖。还有气泡也可引起阴阳分明的着色,只是不着 色区域是圆形,由于气泡中含气体,试剂被推到周围,因此,气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻,有气泡时用牙签捅破。

4、 灶片状着色
    切片中着色区东一块西一块,呈灶片状分布,出现这种问题的原因有:
 (1)、裱片时水未排尽,在局部形成气泡使组织突起,染色时试剂渗入后不易洗尽,显色过深所致。解决办法是,漂片盒里的气泡应去尽,晾片热台不能平放,应有45度左右的斜度,利于水流走和蒸发。
 (2)、坏死组织灶,组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解,复杂的肽链残段(如Fc段)可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。

5、 间质着色
       着色部位主要在间质,间质着色的原因很多,如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色,加一抗前的血清封闭这一步就是为了避 免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质,很容易与抗体结合,造成间质着色,特别是lambda和kappa染色时。当甲状腺胶质外 溢到组织间质时,做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色。

6、 细胞浆着色
       着色区局限在细胞内,间质无着色,看上去与真实的免疫反应着色几乎一样,很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质,因此,很多非特异性的染色除了见于间质也可以 出现在胞浆中。这种原因造成的着色,可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色,如血红蛋白(红细胞)、肌红蛋白(肌细胞)、细胞色素(粒细胞、单核 细胞)、过氧化氢酶(肝、肾),这些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色,这种着色不易避免,但可以通过形态学辨认 出巨噬细胞而引起重视。

7、 细胞核着色
  不适当的组织处理可以出现细胞核着色,如组织在二甲苯里浸泡时间太长、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少,未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。